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實例應用:MDCK細胞的生物反應器微載體培養(yǎng)方法

 更新時間:2022-05-05 點擊量:1368

MDCK細胞屬于動物細胞一般采用Cytodex 作為微載體Cytodex 主要有兩個系列 即:Cytodex 和 Cytopore ,其中 Cytodex 1適合大多數的貼壁細胞。

采用Cytodex 微載體的優(yōu)勢主要有以下幾點:

1. Cytodex 微載體的表面比較適宜細胞的粘附和延展。

2. 優(yōu)化后的大小和密度對于細胞懸浮較為有利,適宜細胞的生長和高產。

3. 這類細胞的細胞基質具有一定的生物惰性,可以減少攪拌培養(yǎng)過程中的剪切力損害。

4. Cytodex 微載體具有較好的可放大性。試驗證明,良好的培養(yǎng)環(huán)境下采用搏旅懸浮細胞培養(yǎng)生物反應器可達 15,000 L產量規(guī)模,而采用貼壁細胞微載體培養(yǎng)生物反應器可達 6,000 L 左右的規(guī)模。

微載體

MDCK細胞的生物反應器微載體培養(yǎng)方法主要有以下幾個步驟:

一、微載體的前處理:

pH7.4PBS緩沖液將Cytodex系列微載體浸泡3~24H;反復清洗后用高壓進行滅菌,冷卻。并用含牛血清的培養(yǎng)基清洗后并加入同體積的培養(yǎng)基備用。2

二、MDCK種子細胞的解凍復蘇:

取出凍存中MDCK細胞,置于37℃-39℃恒溫水浴振蕩器進行解凍復蘇,再植入細胞培養(yǎng)瓶中進行細胞培養(yǎng)。

三、細胞的轉瓶擴培

當細胞培養(yǎng)瓶中的細胞生長到90%密度時用細胞消化液處理細胞,并接入搖瓶進行分瓶培養(yǎng),當細胞生長到同樣密度時,用培養(yǎng)基稀釋接入生物反應器進行擴培。

四、生物反應器微載體培養(yǎng):

MDCK細胞接種可以依照 比例為2-25g微載體/L(培養(yǎng)基)、5-50個細胞/載體的比例接入生物反應器中進行擴大培養(yǎng)。具體詳盡參數可以根據相關的《胞培養(yǎng)操作說明》進行設定調整。

五、病毒的感染接種:

生物反應器培養(yǎng)的MDCK細胞90%微載體表面形成致密層后,應當停止攪拌,微載體沉淀于生物反應器的地步是,更新培養(yǎng)基,按照TPCK胰酶1-20μg/ml、病毒感染復數0.01-1接種病毒培養(yǎng)2h后,補充培養(yǎng)基與原來的量相一致;

六、病毒收獲

當病毒接種10H后,需要每小時取樣觀察細胞病變效應及CPE值,當CPE值大達80%以上時,即可進行病毒收獲、分析測定等操作環(huán)節(jié),結合分析結果與相關《檢驗規(guī)程》執(zhí)行下一步操作。


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