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原生質(zhì)體葉肉細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)方法

 更新時(shí)間:2022-12-16 點(diǎn)擊量:1214


1、 生長(zhǎng)培養(yǎng)好的試驗(yàn)材料(一般為生長(zhǎng)20天左右的擬南芥幼苗葉片)

2、 在擬南芥開花前取樣(30片葉子左右即可)

3、 切取葉片為0.5-1mm的細(xì)條(如果材料能達(dá)到每克107個(gè)原生質(zhì)體, 10-20片葉子需要5-10mL酶解液)

4、 迅速將切下的樣品轉(zhuǎn)到酶解液中,要求全部浸沒。

5、 黑暗條件下抽真空30min。

6、 連續(xù)酶解,室溫下23℃黑暗中靜止酶解3h

7、 利用光學(xué)顯微鏡檢查原生質(zhì)體(30-50μm大?。?/span>

8、 在過濾前加入等量的W5溶液

9、 洗干凈濾網(wǎng),并用W5潤(rùn)濕,之后過濾

10、 離心100g,1-2min沉淀原生質(zhì)體,盡可能吸走上清,重復(fù)洗2 

11、 重懸原生質(zhì)體于W5中,保持在2*105個(gè) /ml,冰浴30min。

12、 100g離心2min,盡可能吸走上清,利用MMG重懸,濃度約 2*105個(gè)/ml

13、 加入10μL質(zhì)粒(1000ng-2000ng )于2ml離心管中

14、 加入100μL原生質(zhì)體(2*104個(gè)),輕輕混勻。

15、 110μL PEG solution,輕彈使充分混勻

16、 23℃室溫孵育30min。

17、 400-440μL W5混勻,終止反應(yīng)

18、 100g,2min 23℃離心,去上清,重復(fù)洗一次

19、 1mL W5重懸原生質(zhì)體并放入6孔板中培養(yǎng)

20、 20-25℃孵育16h以上

21、 取樣制片觀察


溶液配制:

1、 酶解液的配制(20ml


試劑終濃度質(zhì)量/g
MES20mM0.08528KOH調(diào)pH5.7
D-Mannitol0.4M1.45736
KCl20mM0.02982
macerozyme R-100.40%0.08
Cellulase R-101.50%0.3
55℃水浴10min,待冷卻后再加以下試劑
CaCl2·2H2O10mM0.029402
BSA0.10%0.02




W5溶液配制(500mL


試劑終濃度質(zhì)量/g
MES2mM0.19524KOH調(diào)pH5.7
NaCl154mM4.49988
CaCl2·2H2O125mM9.18825
KCl5mM0.186375
MMG配制(100mL


試劑終濃度質(zhì)量/g
MES4mM0.078096KOH調(diào)pH5.7
D-Mannitol0.4M7.2868
MgCl2·6H2O15mM0.30495
PEG配制(10mL


試劑終濃度質(zhì)量/g
PEG 400040%4
D-Mannitol0.2M0.36434
CaCl2·2H2O100mM0.14701

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