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評估ELISA實驗數(shù)據(jù)指標(biāo)有哪些?

 更新時間:2023-08-09 點擊量:1285

ELISA實驗常用于檢測和定量復(fù)雜混合物中的特定蛋白質(zhì)。結(jié)果出來后,就需要一定的方法來評估數(shù)據(jù)是否可靠。主要從以下幾個方面進行評估:檢測內(nèi)精度,稀釋線性度,回收率,靈敏度(檢測限)等。

檢測內(nèi)精度

檢測內(nèi)精度:一般是檢測孔板間的重復(fù)性。一般用變異系數(shù)CV值來評估,變異系數(shù)(CV)為標(biāo)準(zhǔn)差σ與平均數(shù)µ的比值。每個樣品的 %CV 通常應(yīng)小于 10%,%CV越大代表孔間差異大,重復(fù)性不好,結(jié)果不可信。

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注:CV較大可由以下原因引起: 移液不準(zhǔn)確;在使用前確保槍頭在移液器上套牢,確保吸取正確的液體量;試劑濺入其他孔中;樣本或試劑受細(xì)菌或真菌污染;試劑間交叉污染;酶標(biāo)板各處溫度不一致,確保酶標(biāo)板在遠(yuǎn)離氣流的恒溫環(huán)境中孵育;部分孔干透,確保酶標(biāo)板在孵育過程中始終處于被封蓋狀態(tài)。

稀釋線性度

稀釋線性度:稀釋線性度是指不同稀釋水平下測試樣品的結(jié)果精度。不同稀釋倍數(shù)下的測量值與精確值的比值應(yīng)該在70%-130%之間。

在沒有基質(zhì)干擾時,無論如何稀釋,測量值都和真實值吻合。而有基質(zhì)干擾時,樣品稀釋會導(dǎo)致基質(zhì)被稀釋,會造成非特異性結(jié)合比例的減少,測量值也會隨稀釋倍數(shù)的改變而改變。

回收率

回收率:回收率用于確定目標(biāo)物質(zhì)檢測是否受樣品基質(zhì)差異的影響。例如,待測上清液中所含的大量蛋白質(zhì)可能會阻礙抗體結(jié)合,提高信噪比,從而導(dǎo)致目標(biāo)物質(zhì)檢測的濃度低于實際值。通過將已知濃度的目標(biāo)物質(zhì)加入到不同的樣品基質(zhì)中來確定回收率。如果平均回收率為 80%-120%,則認(rèn)為樣品基質(zhì)對檢測準(zhǔn)確定量分析物的能力影響最小?;厥章?用基質(zhì)稀釋的目標(biāo)物質(zhì)的檢測值/用基質(zhì)稀釋的目標(biāo)物質(zhì)的確定值*100%。

回收率過高或是過低,則提示實驗體系受到較大的復(fù)雜基質(zhì)干擾。比如在空白血清中摻入了 1000 pg/mL 的 IL-2,回收率只有 50%,提示血清中有干擾因素影響了抗體與 IL-2 分子的結(jié)合。

靈敏度(檢測限)

靈敏度(檢測限):靈敏度指可與背景區(qū)分的低分析物水平,通常稱為分析靈敏度或檢測限。一般有三個指標(biāo),分別為LOB,LOD,LOQ。

LOB(Limit of blank), 就是我們通常講的空白檢測限。LOB指的是用空白樣本去測試,在一定的概率下能測得的最高測量結(jié)果。

LOD(Limit of detection), 就是我們通常講的檢測限,就不是用空白樣本去檢測了,是對低濃度的分析物樣本進行測試,在一定的概率的條件下能測得的低值。

LOQ(Limit of quantitation), 就是我們通常講的定量限,這個也是用低濃度的分析物樣本進行測試得出的較低的值,這個值的準(zhǔn)確性是有要求的,就是不光要能測到,而且還要保證結(jié)果是準(zhǔn)確的。

打個比方:比如遠(yuǎn)處一個物體,隨著距離的縮短,你的眼睛從看不見(空白檢測限)到能看見(檢測限),最后到能確認(rèn)是什么物體(定量限)。

信噪比

信噪比(Signal/Noise, S/N)就是信號與噪音的比值,也就是樣品數(shù)據(jù)與空白數(shù)據(jù)的比值。一般以信噪比為 3 : 1 時相應(yīng)濃度或量確定檢測限, 10:1時的量為定量限。

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